技术分享丨PCR引物设计方法详解

1. 长度：最佳范围 18-30个碱基

◾ 过短： 特异性降低，可能与非靶序列结合。

◾ 过长： 降低退火效率，增加非特异性结合机会，且合成成本更高。

2. 解链温度

◾ Tm值： 引物与其互补序列杂交时，50%双链解离成单链时的温度，常用PCR的引物Tm值一般在 55-65℃之间

◾ 要求：正向和反向引物的Tm值应尽量接近，差异最好在 1-2°C 以内。 

3. GC含量：最佳范围 40%-60%

◾ GC含量过高（>65%）： GC碱基对结合力更强，易在非靶位点形成稳定错配，导致非特异性扩增；同时引物自身易形成二级结构。

◾ GC含量过低（<40%）： 引物与模板结合不稳定，扩增效率低。

4. 避免二级结构

◾ 引物二聚体： 引物自身（特别是3’端）之间不能有互补序列，否则会互相结合，消耗引物。

◾ 发夹结构： 引物自身序列内部（特别是3’端）不能有反向互补序列，否则会自身退火，影响与模板结合。

5. 3’端特性

◾ 稳定性： 3’末端的最后1-2个碱基应为 G或C，因为GC配对更稳定，有助于引物正确“锚定”在模板上，这称为 “GC夹子”。

◾ 严禁错配： 3’端最后一个碱基绝对不能发生错配，否则会严重影响Taq酶的延伸效率。

6. 特异性

◾ BLAST验证： 设计好的引物序列必须在NCBI的 Primer-BLAST 工具中进行比对，确保其只特异性结合到您的目标基因/序列上，而不会与其他基因组序列（如同源基因、假基因）结合。

1. 用于定量PCR

◾ 跨外显子设计（针对cDNA）：引物最好设计在两个外显子的交界处，或使引物跨过内含子区域。这样可以有效区分cDNA（目标产物）和基因组DNA污染。

◾ 产物长度： 80-200 bp。更短的产物扩增效率更高，在qPCR的指数增长期内更容易达到荧光阈值。

◾ 扩增效率：理想的扩增效率应在 90%-110% 之间。

 

2. 用于基因克隆

◾ 上游引物设计在ATG上游，并引入酶切位点及保护碱基，下游设计在TAA下游，同样引入酶切位点及保护碱基

◾ 产物长度：根据克隆片段大小决定，无严格限制，但过长会降低PCR效率。

 

3. 用于基因分型

◾ 结合SNP位点：将待检测的SNP位点设计在扩增子内部用于后续测序、酶切分析。

◾ 高度特异性：必须确保引物在SNP位点两侧的序列是唯 1 的，避免与其他同源区域交叉反应。

 

4. 用于MSP甲基化检测

◾ M引物： 在引物3’末端必须包含1-3个CpG位点，且这些位点在设计中仍为 “CG” 。这是特异性识别甲基化DNA的关键。

◾ U引物： 在引物3’末端对应的位置，必须将“CG”设计为 “TG” 或 “TA”。这是特异性识别未甲基化DNA的关键。

 

5. 用于BSP甲基化检测

◾ 引物结合区域内不应包含任何CpG位点。

◾ 如果无法避开，使用简并碱基（如Y代表C/T，R代表A/G）。但这是下策，会降低引物效率和特异性。

第三部分：引物设计详细步骤

1. 进入NCBI网站，查找目标基因

 

2.点击search，选择合适的种属。

 

3. 选择目标基因，下拉选择合适的转录本。

 

4.进入Pick Primers进行引物设计

 

5.选择符合要求的引物，并进行比对以确认特异性